肝再生增强因子

黄志刚 （邯郸高等医学专科学校医学检验系，邯郸056002） 关键词：肝再生增强因子；基因克隆 中图分类号：R333.4     肝脏是机体具有强大再生能力的脏器，目前已知的肝再生相关因子如肝细胞生长因子（HGF）、转化生长因子-α(TGF-α）、表皮生长因子（EGF）等，均难以解释具有器官特异性的肝再生调控机制，因此寻找新型肝再生调控因子一直是该领域的热点[1]。1994年8月，Hagiya等[2]从初断乳大鼠肝组织中克隆到一种新型的促肝细胞增殖因子，称为肝强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）。近来研究发现，ALR是一种特殊的促肝细胞分裂原，在肝损伤修复过程中发挥重要作用。 1. ALR基因     大鼠ALR cDNA全长约1.2kb，由三部分组成：299bp的5`非翻译区；375bp的编码区和550bp的3`非翻译区[2]。杨晓明等根据大鼠ALR cDNA序列合成引物，利用PCR技术对人胎肝cDNA文库进行矩陈排列筛选，成功获得人ALR cDNA克隆。对比发现人ALR cDNA全长在1.5kb以上，略高于大鼠，推测可能有更长的5`、3`非翻译区序列，二者cDNA编码区序列存在87%同源性[3]。     ALR作为一种新型的细胞因子，与其他亲肝细胞生长因子在基因结构上无任何关系，但其编码区基因与酵母菌核基因EVR1(essential for respiration and viability 1)有50%同源性[4]。ERV1基因是由Lisowsky[5]于1992年在筛选啤酒酵母温敏突变体时发现，该基因在酿酒酵母氧化磷酸化与营养性生长中具有双重作用，不仅是线粒体呼吸链的一部分，而且在细胞生长调控过程中起关键作用。1995年Lisowsky等通过定位克隆从人16号染色体上多囊肾病基因区域获得人源EVR1基因，其cDNA序列与随后在美国专利中公开的人ALR序列及国内杨晓明等报道的人ALR序列一致。因此认为ALR与酵母ERV1基因的人同源体蛋白为同一分子，ALR基因可能与核基因ERV1相似，是一种重要的生长调控基因[1]。 2. ALR基因的表达     最早人们认为ALR具有肝特异性，但ALR mR-NA在肝外组织的表达否定了这一点。Francavilla等[4]以大鼠全长ALR cDNA为探针，与从大鼠不同组织提取的总RNA进行分子杂交，发现除肝脏外大鼠ALR mRNA在许多组织都有表达，其表达丰度在心脏、脑、脾、肺、骨骼肌和肾脏相对较低，而在睾丸组织丰度较高，似乎提示有丝分裂活跃的细胞存在ALR mRNA的高表达。杨晓明等[6]从4月龄人胚胎的不同组织中提取总RNA行Northern杂交，发现ALR mRNA在胸腺及肾脏的表达丰度较高，而在肺、脾和大脑则无表达，与大鼠ALR mRNA的组织表达不同，ALR mRNA表达是否存在种属差异，还有待于深入研究。 3. ALR的分子结构及理化特性     ALR是一种多肽调节因子，由125个氨基酸构成，相对分子量为15kD，与含还原剂的SDS-PAGE检测结果一致。而从动物体内提纯的天然ALR，经不含还原剂的SDS-PAGE分析，其分子量约为30kD，提示ALR在体内可能存在同源二聚体结构，另外，在ALR分子氨基端及内部缺乏一段疏水性氨基酸序列（信号肽）。ALR是如何分泌到细胞外的，至今尚无定论。有学者认为，ALR的分泌可能与IL-1B和硫氧还原蛋白类似，并不依靠经典的内质网-高尔基体胞内膜转运机制，而是通过一条新途径进行[2]。Francavilla等[4]研究发现，ALR具热稳定性和免疫原性，耐神经氨酸酶、SDS和还原剂的作用，胰酶消化可使之破坏。该因子无器官特异性种属特异性，在pH值4.5-7.5条件下性质稳定。pH值6.5时，等电点为4.0，这与该因子大部分是由酸性氨基酸构成的特点一致。人类ALR氨基酸序列与大鼠有84.8%同源性，C端的33个氨基酸在人和大鼠之间序列相同，推测这一区域对ALR分子的生物学特性可能具有重要作用。 4. ALR的生物学功能 4.1 ALR与肝细胞    杨晓明等[7]采用大鼠1/3肝切除模型（partail hepatotmy, PH）,通过3H-TdR参入法研究了ALR与肝细胞的关系。结果发现，重组大鼠ALR可促进1/3PH大鼠肝细胞DNA合成（p<0.05）。1/3PH模型是用于观察各生长因子对肝细胞DNA合成影响的经典模型。ALR对该模型肝细胞增殖的刺激作用表明，ALR可能是一种重要的肝再生调控因子。随后进行的体外实验也证实了这一观点。在原代肝细胞培养体系（无血清）中，ALR可刺激肝细胞DNA合成，并具有剂量-效应正相关。在20μg/L时，ALR可使肝细胞DNA合成增加2.9倍，略高于同剂量下EGF的刺激作用（增加2.4倍），但较TGF-α活性低（增加3.9倍）[8]。 4.2 ALR与肝NK细胞    肝脏自然杀伤细胞（NK）在肝再生过程中具有重要的调控作用。Francavilla等[9]给予正常大鼠一定剂量（可引起肝细胞增殖活性）的ALR后，观察肝脏NK细胞的变化。结果发现，肝脏单核白细胞总体中NK细胞的细胞毒活性受到抑制，而脾脏和外周血的单核白细胞却不受影响。在体外实验中，将ALR分别加入来自大鼠肝脏、脾脏和外周血的单核细胞培养皿中，并未观察到ALR对NK细胞的影响作用。结果提示，ALR在体内可能通过某种未知的媒介机制特异调控肝脏NK细胞，来发挥其肝再生方面的重要作用。 4.3 ALR与肝再生    ALR与众多亲肝细胞因子一样也参与肝再生的调节。杨晓明等[10]抽提2/3PH术后12、24和48h再生肝组织总RNA，经Northern杂交检测ALR mRNA在再生肝组织中的表达丰度。研究发现，正常肝组织仅有低丰度表达，2/3PH后12h，肝组织ALR mRNA表达明显增加，并于术后24h达高峰，丰度可增加4倍。已有研究报道，2/3PH后24h大鼠肝组织DNA合成达高峰，因此肝损伤后ALR mRNA表达增加（12h）早于肝细胞DNA合成高峰，提示ALR可能是一种重要的肝再生刺激因子。但ALR与HGF(PH后1-2h表达增加)、TGF-α(PH后4h表达增加)等启动肝再生的生长因子不同，ALR mRNA表达丰度增加相对较迟(PH后12h)。因此，ALR虽可刺激肝再生，但并不是启动肝再生的因子。 4.4 ALR与免疫抑制剂FK506CyA    FK506(tacrolimus)和CyA(cyclosporin A)是两种作用较强的免疫抑剂，具有刺激肝再生和抑制淋巴细胞增殖双重作用。Francavilla等[11]研究认为，ALR与FK506和CyA的作用相近。把经ALR处理（36h内分多次肌肉注射，总剂量为2.5g/kg）后大鼠肝脏分离出的淋巴细胞作为实验组，在不同浓度的ConA或IL-2存在下，研究淋巴细胞的增殖活性。未经处理的大鼠肝脏、脾脏和血液中分离出淋巴细胞为对照。结果发现，在各实验条件下对照组淋巴细胞增殖活性未见改变。而实验组淋巴细胞在ConA存在条件下，增殖活性显著降低（P<0.005）。另外，在70%PH后24h和48h，从肝组织分离的淋巴细胞，在ConA和IL-2存在条件下，其增殖活性也显著降低（P<0.0005）。结果表明，肝再生时期，淋巴细胞受到严格的负调控作用，这种抑制可阻止淋巴细胞对分裂期肝细胞毒作用。而处于增殖期的肝细胞，由于暂时的抗原修饰，可能对杀伤作用非常敏感。ALR在体内可抑制肝淋巴细胞活性，在一定程度上保证了肝再生的进行。可见ALR与CyA和FK506相似，具有刺激肝细胞再生和抑制淋巴细胞增殖双重作用。ALR可能是一种生理性的免疫抑制剂，对肝细胞的生长调控起重要作用。 4.5 ALR与肝脏疾病 4.5.1  ALR与急性肝损伤    谢玲等[12]观察了重组大鼠ALR对CCl4诱导的急性肝衷竭大鼠的救治作用。重组大鼠ALR在体内可提高CCl4诱导的急性肝衷竭大鼠的存活率（40%），与对照组（15%）相比有显著性差异（P<0.01）。急性肝衷竭大鼠经ALR治疗后，血清ALT、AST水平较对照组有明显降低（P<0.05），提示重组ALR可能具有阻止肝细胞坏死的作用。杨晓明等[8]在原代培养肝细胞体系中加入5mmol/L CCl4模拟体内肝损伤情况，并选择LDH释放及肝细胞存活善为指标进行了观察。结果发现，ALR对正常肝细胞LDH释放无明显影响，而可明显抑制CCl4诱导的损伤肝细胞LDH的释放，这种作用在各时间点均存在且具有剂量-效应正相关。以MTS法检测细胞存活数发现，在5mmol/L CCl4存在条件下培养24h，细胞存活数明显下降，ALR组存活数明显高于对照组（P<0.05）。可见，ALR在肝损伤修复过程中可能发挥重要作用。 4.5.2 ALR与慢性肝损伤    已有研究表明，促肝细胞增殖因子中肝细胞生长因子（HGF）和肝细胞刺激因子（HSS）具有抗慢性肝损伤作用。ALR有无类似作用？王爱民等[13]以CCl4诱导的实验性肝纤维化大鼠为模型，对重组ALR的抗慢性肝损伤作用进行了研究。结果显示，ALR可提高慢性肝损伤大鼠的存活率（模型组55%,治疗组85%，P<0.05），并可显著降低肝纤维化大鼠血清ALT、AST和LDH水平。病理检查可见，ALR治疗组大鼠肝脏汇管区及小叶间纤维组织增生较模型组显著为轻。肝组织胶原蛋白含量测定证实，ALR治疗组胶原蛋白含量显著低于模型组，提示ALR具有明显的抗纤维化活性。 4.6 ALR与糖尿病    Adams等[14]选用Streptozo-tocin糖尿病大鼠（血糖〉300mg/dl）,使其接受胚胎胰腺移植治疗（fetal pancreas,FP）。使其接受胚胎胰腺移植治疗（fetal pancreas, FP）。将接受治疗的大鼠随机分为两组，实验组给予ALR40和400ng/(kg.d)-1共14天；对照组给相同剂量的溶剂。观察3个月，并连续测定体重和血糖水平。结果发现，ALR 40ng/(kg.d)-1组，89%大鼠（8/9）血糖恢复正常（P=0.0003）；ALR 400ng/(kg.d)-1组，88%（7/8）血糖正常（P=0.0007）。对照组无一血糖正常（规定血糖连续3天<200mg/dl即为正常）。该研究表明，ALR可显著提高糖尿病具有较好的辅助治疗作用。 5. ALR和HSS     在众多促肝细胞增殖因子中，肝细胞刺激因子（hepatic stimulatory substance,HSS）与ALR性质最为相似。1975年，LaBrecque等[15]首先报道在PH术后大鼠再生肝胞质中存在一种热稳定性的肝细胞增殖刺激因子，称肝细胞刺激因子（HSS）。随后研究证实，该因子广泛存在于哺乳动物幼仔肝、胚胎肝及再生肝组织中，成年动物正常肝中含量甚微。HSS分子量约为12-18kD，具有热稳定性和器官特异性，无种属特异性。在体内外均具有刺激肝源细胞DNA合成的作用，对其它来源的细胞无刺激作用。因HSS在体内含量低，纯化难度大，加之蛋白质氨基的封闭，其氨基酸序列一直未能确定。ALR发现初始，因其在组织来源、理化特性上与HSS极为相似，有人认为ALR即是LaBrecque所描述的HSS。Hagiya等[2]报道ALR仅在体内具有生物活性，认为ALR与HSS应为两种不同的因子，并推测ALR可能通过调控肝间质细胞发挥生物学作用。随后杨晓明等完成人类ALR同源分子cDNA克隆[3]，并证明ALR与HSS相似在体内外均具有刺激肝细胞DNA合成的作用[7,8]。研究发现，ALR与HSS都可提高CCl4诱导的急性肝衷竭大鼠的存活率，并对实验性慢性肝损伤具有保护作用[13]。ALR与HSS共有的理化特性和生物学作用在其它促肝细胞增殖因子中是罕见的，ALR与HSS的确切关系尚有待于进一步研究。 参考文献： 贺福初等。科学通报，1997，42：41 Hagiya M et al. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:8142-8146 杨晓明等。军事医学科学院院刊，1996,20:241 Francavilla A et al. Hepatology,1994,20:747-752 Lisowsky T.Mol Gen Genet,1992,232:58-63 杨晓明等。中国科学（C辑），1997,27:463 杨晓明等。生物化学杂志，1997,13:130 杨晓明等。科学通报，1998,43:616 Francavilla A et al. Hepatology,1997,25(2):411-415 杨晓明等。生理学季，1997,49:599 Francavilla A et al. Heptology,1994,20(4):223 谢玲等。中国应用生理学杂志，1996,12:324 王爱民等。中华医学杂志，1998,78:707-709 Adams GA et al. Transplantation,1998,15(65):32-36 LaBrecque DR.Dig Dis Sci,1991,36:669-673